Главная страница Карта сайта Контактная информация Закрытый раздел для сотрудников и студентов кафедры Старая версия сайта






Латеральная диффузия ацетилхолиновых рецепторов в механизме кратковременной депрессии холиночувствительности командных нейронов


уководитель: д.б.н. Пивоваров А.С.

Творческий коллектив:


Васильева Наталья Александровна
научный сотрудник

Пивоваров Аркадий Саулович
главный научный сотрудник
доктор биологических наук

Третьякова Мария Сергеевна
младший научный сотрудник
кандидат биологических наук

Ястребова Светлана Борисовна
учебный мастер

Работа выполняется совместно с Институтом высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (соисполнитель ст.н.с. Мурзина Г.Б.)

Работа выполняется при поддержке РФФИ (проект № 16-04-00099А)

Описание направления

Helix Lucorum
Helix Lucorum


Экспериментальная
электрофизиологическая
установка в к. 440


Привыкание – простая форма обучения.
Привыкание, или габитуация это постепенное ослабление рефлекторной реакции животного на монотонно повторяемое раздражение [Кэндел, 1980; Rankin et al., 2009]. Угашенная реакция восстанавливается спонтанно после прекращения ритмического раздражения или возрастания межстимульного интервала, а также после действия другого сильного стимула (экстрастимула). Привыкание называют негативным научением [Соколов, 1981], поскольку животное учится не реагировать на биологически малозначимый стимул. Это самая простая форма обучения [Кэндел, 1980; Rankin et al., 2009]. В поведенческих экспериментах на виноградной улитке ритмическая тактильная стимуляция (10 повторных тактильных раздражений постоянной силы, которые наносили на одну и ту же область ноги), вызывала ослабление оборонительной реакции животного. Сниженная оборонительная реакция спонтанно восстанавливалась после перерыва (10-15 мин) в стимуляции. Выявлено такое свойство поведенческого привыкания, как «растормаживание» уменьшенной реакции животного на повторяющийся раздражитель, когда действие экстрастимула приводило к достоверно большему (на 33.02+10.53%) увеличению амплитуды оборонительной реакции улитки по сравнению с контролем, в котором действие экстрастимула отсутствовало [Нистратова, Пивоваров, 2004].

Искусственный синапс
Искусственный синапс

Протокол эксперимента
Протокол эксперимента


На командных нейронах ЛПа2, ЛПа3, ППа3, ППа2, управляющих оборонительным поведением виноградной улитки, ритмическая аппликация АХ на сому приводила к обратимому снижению холиночувствительности нейрона, что следовало из падения амплитуды вызванного АХ-тока. Это изменение можно рассматривать как клеточный аналог привыкания, поскольку в электрофизиологических экспериментах схема химической стимуляции командного нейрона имитировала схему тактильной стимуляции в поведенческих экспериментах [Пивоваров, 1992], а кривые депрессии оборонительной реакции и АХ-тока имели сходную динамику.


Мобильность медиаторных рецепторов.
Увеличение числа рецепторов обеспечивает долговременную потенциацию и формирования памяти, а редукция числа мембранных рецепторов лежит в основе долговременной депрессии и забывания [Collingridge et al., 2004]. Выделяют два вида мобильности рецепторов: 1) радиальную мобильность, которая является результатом взаимодействия процессов интернализации и рециклирования рецепторов за счет эндоцитоза и экзоцитоза, соответственно, а также 2) латеральную мобильность [Thomas et al., 2005]. В функционирующем синапсе изменение числа рецепторов зависит от трех процессов: 1) формирования или распада рецепторных кластеров, 2) эндо- и экзоцитоза свободных рецепторов, 3) диффузии рецепторов в/из постсинаптической зоны. Изучение процессов мобильности АХР в условиях клеточного аналога привыкания на нейронах виноградной улитки позволит не только выяснить механизмы этих процессов, но и использовать полученные закономерности при изучении более сложные формы обучения на различных типах нейронов.

Пример депрессии АХ-тока
Пример депрессии АХ-тока

По своей подвижности рецепторы на мембране могут находится в двух основных состояниях: «свободном» и «связанном» с примембранным цитоскелетом. Связанные рецепторы взаимодействуют с цитоскелетом через различные якорные белки. Для АХР таким белком является рапсин/43. Рапсин взаимодействует непосредственно с никотиновым АХР и играет существенную роль в агрин-индуцируемой кластеризации АХР. Так под действием белка агрина при участии ассоциированного с никотиновым рецептором мембранного белка рапсина/43К в области постсинаптической плотности связанные АХР формируют кластеры [Apel, 1995; Conroy, Berg, 1999]. В эмбриональном нервно-мышечном синапсе для кластеризации АХР кроме рапсина необходима еще активация протеинкиназы G [Godfrey et al, 2007]. Свойства кластерных рецепторов могут несколько отличаться от свойств свободных рецепторов [Мурзина, 2008]. Кластеры достаточно стабильные структуры, и как целое могут существовать достаточно долго, являясь основой памяти. Однако рецепторы, их формирующие, имеют ограниченное время жизни. Поэтому осуществляется постоянное перемещение – «перескок» рецепторов из связанного в свободное состояние. «Свободные» рецепторы могут участвовать в двух типах движений по мембране: диффузии (в область низкой концентрации рецепторов) и транспорте (с участием других белков к определенным локусам мембраны). Латеральная диффузия рецепторов. В латеральной диффузии рецепторов (ЛДР) участвуют только «свободные» рецепторы. Коэффициент диффузии зависит как от свойств мембраны - ее текучести (вязкости), так и от состояния актинового цитоскелета, взаимодействующего с ней. Показано, что актиновые нити образуют примембранную двухмерную решетку (размером 3-5 нм) в форме «забора» или «коралла», параллельную плазматической мембране [Allison et al., 2000].

Кривая обратимой депрессии тока

Связь актинового цитоскелета с мембраной осуществляют актинсвязывающие белки – спектрин, мерлин из семейства, включающего такие белки как эзрин, радиксин и моэзин (ЭРМ), [Nakamura et al., 2000]. Любые воздействия на эти белки, приводящие к разрушению или, наоборот, к стабилизации актиновой решетки, влияют на коэффициент латеральной диффузии рецепторов, изменяя, таким образом, латеральную мобильность мембранных рецепторов. Показано, что активация, в частности, мерлина изолирует мембранные рецепторы в нерастворимой фракции мембраны, снижая латеральную мобильность рецепторов и тормозя их интернализацию [Apodaca, 2001; Cole et al., 2008]. Изменение коэффициента ЛДР, зависящего от состояния примембранного матрикса, может происходить при изменении состояния актиновых нитей вследствие воздействия на них различных протеинкиназ и протеинфосфатаз. Деполимеризация актина будет приводить к увеличению мобильности мембранных рецепторов и, следовательно, к увеличению коэффициента ЛДР, а стабилизация примембранного матрикса, наоборот, - к уменьшению скорости ЛДР. В частности, с наличием быстрой латеральной диффузии функциональных мембранных АХР на эмбриональных мышечных клетках Xenopus связывают частичное восстановление сниженной амплитуды деполяризации клеток в ответ на частые (1 Гц) ритмические локальные подведения АХ после кратковременной аппликации в зону тестирования необратимого антагониста никотиновых АХР альфа-бунгаротоксина [Young, Poo,1983].

Латеральный транспорт рецепторов по мембране. Кроме диффузии мембранные рецепторы могут участвовать в ином перемещении по мембране – транспортировке. Такое перемещение возможно, если активированные медиатором рецепторы вследствие взаимодействия с белками, аналогичными бета-аррестину (имеющему большое сродство к клатрину) становятся способными взаимодействовать с миозином VI. Как любой актин-миозиновый транспорт такое перемещение требует затрат энергии, и осуществляется уже с большей скоростью, чем диффузия, и происходит в определенном направлении. Полагают, что в поляризованных клетках миозин VI участвует в транспорте лиганд-связанных рецепторов к клатриновым ямкам, формировании содержащих рецепторы клатриновых везикул, их отсоединении и транспорте сформированных везикул по актиновым нитям к ранним эндосомам внутрь клетки. Все перемещения происходят от «плюс» к «минус» концу актина. Осуществление этих функций миозином VI происходит при взаимодействии его хвостовой области с адапторными белками: Dab2 (disabled 2, Dab, mitogen-responsive phosphoprotein, homolog 2), GIPC (GAIP-связанный-белок-С-окончание) и SAP97 (связанный с синапсом белок 97) [Morris et al., 2002; Hasson, 2003]. В шипиках область синапсов формируют преимущественно рецепторные кластеры, а клатриновые белки расположены на границе головки шипиков. Поэтому туда из синапса осуществляется транспорт рецепторов. Что же касается соматической мембраны, то там, вероятно, формирование кластерной ямки может происходить в любом месте, где «стихийно» возникает локализация некоторого количества транспортируемых рецепторов, связанных с белками, имеющими повышенное сродство к клатрину. Взаимодействие их с клатрином, распределенным первоначально диффузно по мембране, приводит к началу формирования клатриновой ямки и стоку в это место других рецепторов (преимущественно транспортируемых, но возможно, в меньших количествах и свободно диффундирующих).


Моделирование мобильности рецепторов. Математическое моделирование депрессии холиночувствительности командных нейронов виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания позволило сделать вывод о необходимости учитывать изменение латеральной диффузии рецепторов при изучении процессов, вызывающих изменения реакции клетки на внешние химические воздействия [Мурзина, 2013]. Для нервных клеток это - изменение синаптической эффективности. Для диффундирующих рецепторов, как и для транспортируемых, важно состояние примембранного матрикса. Стабилизация примембранного цитоскелета будет приводить к уменьшению диффузии мембранных рецепторов и к стабилизации эндоцитоза и экзоцитоза рецепторов. Расчеты показали [Мурзина, 2013], что в случае постоянного коэффициента ЛДР уменьшение уровня депрессии АХ-тока при увеличении интервала времени между аппликациями медиатора связано с увеличением эффективности экзоцитоза рецепторов. Вследствие этого большее количество рецепторов «возвращается» на мембрану к моменту следующей аппликации медиатора. Однако если в нейроне протекают процессы, приводящие к изменению вязкости мембраны, и тем самым, влияющие на коэффициент ЛДР, то временной диапазон межстимульных интервалов при выработке депрессии изменяется. Может даже возникнуть ситуация, когда депрессию получить будет практически невозможно, поскольку при большом коэффициенте ЛДР локальное уменьшение числа мембранных рецепторов в области аппликации медиатора незначительно, и небольшая величина депрессии в экспериментах будет находиться в границах разброса контрольных значений. Согласно результатам вычислений [Мурзина, 2013] увеличение коэффициента латеральной диффузии АХР приводит к уменьшению депрессии холиночувствительности нейронов. Это может происходить как вследствие повышения в области аппликации медиатора числа рецепторов, диффундировавших из соседних зон мембраны, так и снижения скоростей радиального транспорта АХР (эндо- и экзоцитоза). В ходе моделирования при определенных соотношениях параметров модели и наличии латеральной диффузии рецепторов на мембране и примембранных эндоцитоза и экзоцитоза рецепторов, в отсутствии остальных перемещений везикул с рецепторами, был получен эффект«постстимульной отдачи» [Мурзина, 2013]. В этом случае после прекращения стимуляции число рецепторов в части локусах мембраны в течение некоторого времени превышает их число до начала стимуляции. Экспериментально этот эффект может наблюдаться при блокаде транспорта везикул с интернализованными рецепторами внутрь нейрона к поздним эндосомам и блокаде транспорта вновь синтезированных везикул. Вероятное участие латеральной диффузии АХР на клеточном аналоге привыкания. Плотность АХР в синапсе является следствием динамического равновесия между синтезом, распадом, интернализацией, рециклированием и диффузией рецепторов в/из синаптической зоны. [Bruneau, Akaaboune, 2006]. При ритмической аппликации АХ число мембраносвязанных АХР снижается в результате их радиального транспорта, в котором доминирует эндоцитоз над экзоцитозом. Вследствие этого в зоне мембраны под АХ-пипеткой число свободных АХР уменьшается, что нарушает существовавший баланс мембранных рецепторов. Это приведет к латеральной диффузии некоторого дополнительного числа АХР в зону тестирования из соседних областей и уменьшению степени депрессии АХ-тока. При достижении фазы плато наступает динамическое равновесие между количеством интернализуемых рецепторов и рецепторов, поступающих в зону тестирования путем латеральной диффузии и незначительного рециклирования. Таким образом, латеральная диффузия АХР выполняет функцию механизма, регулирующего (увеличивающего в данном случае) количество мембранных рецепторов в зоне аппликации АХ.


Действительно, мы никогда не наблюдали полного подавления АХ-тока при ритмической аппликации АХ. Мы полагаем, что при фармакологическом повышении текучести мембраны должны возрастать скорости как латеральной диффузии, так и, возможно, скорости эндоцитоза и экзоцитоза АХР. От соотношения изменения скоростей ЛДР, эндоцитоза и экзоцитоза рецепторов зависит, как изменится при этом плато кривой: депрессия может увеличиться или ослабнуть вплоть до полной блокады и появления временного облегчения АХ-тока, когда скорость ЛДР превышает скорость радиального эндоцитоза. Мобильность холинорецепторов на клеточном аналоге привыкания. При аппликации медиатора число мембраносвязанных АХР в командных нейронах оборонительного поведения виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания снижается в результате изменения баланса внутриклеточных транспортных процессов в сторону преобладания интернализации АХР над их рециклированием [Махновский и др., 2010]. Этот молекулярный механизм обеспечивает обратимую депрессию входящего тока, вызванного ритмическими подведениями АХ к соме командных нейронов и, соответственно, снижение холиночувствительности мембраны.

Основные публикации

  1. Vasil’yeva N.A., Murzina G.B., Pivovarov A.S. (2015) Habituation-Like Decrease of Acetylcholine-Induced Inward Current in Helix Command Neurons: Role of Microtubule Motor Proteins. Cellular and Molecular Neurobiology, Springer, Part of Springer Science+Business Media, том 35, с. 1-10. DOI: 10.1007/s10571-015-0165-y
  2. Pivovarov A.S., Murzina G.B., Makhnovsky D.A., Tret’yakova M.S. (2014) Possibility of “comet-like” transport of acetylcholine receptors in command Helix neurons in cellular analog of habituation. World Journal of Neuroscience, Scientific Research Publishing, том 4, № 2, с. 133-143
  3. Pivovarov A.S., Murzina G.B., Makhnovsky D.A., Tret’yakova M.S., Vasil’yeva N.A. (2013) Mobility of acetylcholine receptors in command Helix lucorum neurons in a cellular analog of habituation. Invertebrate Neuroscience, Springer SBM, том 13, № 2, с. 135-150
  4. Махновский Д.А., Мурзина Г.Б., Пивоваров А.С. (2012) Экзоцитоз холинорецепторов при депрессии вызванного ацетилхолином тока в нейронах виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, том 153, № 4, с. 410-413 DOI
  5. Махновский Д.А., Третьякова М.С., Мурзина Г.Б., Пивоваров А.С. (2010) Эндоцитоз холинорецепторов в механизме депрессии холиночувствительности нейронов виноградной улитки на клеточной модели привыкания. Журнал высшей нервной деятельности им. И. П. Павлова, том 60, № 2, с. 206-216

Возможные темы выпускных работ бакалавра и магистра

Темы квалификационных работ бакалавра:

  1. Влияние веществ, снижающих содержание липида холестерола в мембранах нейронов на их чувствительность к ацетилхолину и внутриклеточный транспорт ацетилхолиновых рецепторов

Темы квалификационных работ магистра:

  1. Роль холестерола в депрессии холиночувствительности командных нейронов виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания




версия для печати






© 2017 Кафедра
Высшей нервной деятельности МГУ

Старая версия сайта



Почтовый адрес:
119234, Россия, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12,
Биологический факультет МГУ.

Телефон: +7 (495) 939-28-37,
Факс: +7 (495) 939-28-37,
заведующий кафедрой профессор Латанов Александр Васильевич

E-mail: info@neurobiology.ru



2015, сделано в